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      FC實驗操作流程

      2022-06-20
      258次

      FC實驗步驟

      一、細胞表面染色操作流程

      1、細胞計數:將培養好的細胞收集于15mL離心管并計數;500g離心4min,去上清;

      2、制備單細胞懸液:將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸,400g離心3min,去上清,重復2次;用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x106個細胞/mL,分配到96孔板中,每孔100μl細胞懸液;

      3、(可選)阻斷Fc受體:室溫孵育10-20min;

      4、一抗孵育:每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl,2-8℃反應30min;

      5、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍;

      6、二抗孵育:對于非熒光染料直標抗體,加入100μl熒光二抗重懸,避光2-8℃反應30min。對于直標抗體直接跳到步驟8;

      7、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍;

      8、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞,4℃保存,上機分析。

      二、細胞胞內染色操作流程

      1、細胞計數:將培養好的細胞收集于15mL離心管并計數;500g離心4min,去上清;

      2、制備單細胞懸液:將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸,400g離心3min,去上清,重復2次;用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x106個細胞/mL,分配到96孔板中,每孔100μl細胞懸液,400g離心5min去上清;

      3、固定:每孔加入100μl細胞固定劑重懸細胞,2-8°孵育20min;

      4、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍;

      5、通透:每孔加入100μl細胞通透劑重懸細胞,室溫孵育20min;

      6、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍;

      7、(可選)阻斷Fc受體:10-20min;

      8、一抗孵育:每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl,2-8℃反應30min;

      9、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍;

      10、二抗孵育:對于非熒光染料直標抗體,加入100μl熒光二抗重懸,避光2-8℃反應30min。對于直標抗體直接跳到步驟11;

      11、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍;

      12、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞,4℃保存,上機分析。


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