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      實驗指南

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      WB實驗操作流程

      2022-06-20
      163次

      WB 實驗步驟

      一、樣本制備

      1、細胞收集

      1.1、貼壁培養細胞收集:去除貼壁細胞的培養液,用預冷 PBS 清洗細胞 2 次,吸出 PBS。

      1.2、懸浮培養細胞收集:先 3000 轉/min 離心 5 分鐘收集細胞沉淀,再用預冷 PBS 輕輕吹打重懸,離心收集細胞沉淀。

      1.3、組織樣本收集:用干凈的醫用剪剪碎目標組織,使組織塊盡量小,此操作最好在冰上進行,并且應盡快完成,以防止樣品被蛋白酶降解。將組織用液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min,迅速用液氮研磨,研磨過程盡量控制在 1-2min 之內,以減少蛋白的降解。

      2、總蛋白提取

      2.1、細胞/組織裂解:對于細胞樣本,加入預冷的 RIPA 裂解緩沖液(含有 PMSF)(每 107 細胞/100 mm 培養皿/150cm2 培養瓶加入 1ml;每 5×106 細胞/60 mm 培養皿/75cm2 培養瓶加 0.5ml),冰上裂解 15min。

      對于組織樣本,按照 1mL 裂解液/100mg 組織向勻漿器中加入蛋白裂解液,多次勻漿,直至組織完全勻漿,收集勻漿液。(裂解液中根據需要選擇添加或不添加蛋白酶抑制劑)。

      2.2、離心

      把裂解好的樣本置于于預冷的高速冷凍離心機中,12000rpm,10min。

      2.3、蛋白變性

      離心完成后,棄去沉淀,保存上清。吸取 10μl 蛋白上清做蛋白濃度(BCA 法)測定。向剩余的蛋白提取液的離心管中加 5×Loading Buffer(最終工作液為 1X),95℃加熱變性 5min,待液體完全冷卻后置于-20℃分裝保存,避免反復凍融。

      二、凝膠電泳

      1、制膠及上樣:

      1.1、配制分離膠,根據蛋白大小,選擇不同濃度的分離膠(見下表)混勻后注入預先按照好的制膠器中,其上加一薄層異丙醇封膠,室溫水平靜置 30min 至凝固。聚合后,可見在頂層異丙醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線。注意:防止氣泡注入;注膠前加入 TEMED,防止注膠前凝固;注入異丙醇時需沿玻板一邊緩慢拖動加入。

      1.2、待分離膠凝固后,傾去其上的異丙醇,以吸水紙吸凈殘余液體,緩緩加入配制好的濃縮膠至玻璃平板夾層, 將樣品梳沿玻板一端緩慢插入夾層的濃縮膠液體中,必要時,再補加濃縮膠液體充盈剩余空間。室溫水平靜置 30min, 待膠完全聚合,凝膠時間視溫度而定。注意樣品梳與膠溶液間避免產生氣泡。

      1.3、將凝膠固定于電泳裝置上,內槽加滿電泳緩沖液,外槽沒過底部 3-5cm 即可。雙手垂直拔出樣品梳。

      1.4、用移液槍吸取樣品垂直梳孔上樣。成分很復雜的蛋白質混合物需加 100~200μg,而成分較少的樣本只需 1-50μg 蛋白量。對照孔加入蛋白質分子量標準品,如有空置的加樣孔,須加等體積的空白 1×Loading Buffer,以防相鄰泳道樣品的擴散。

      分離膠濃度的選擇:

      分子量( kDa

      分離膠濃度

      X≤10

      15%

      10<X≤15

      13.5%

      15<X≤25

      12%

      25<X≤35

      11%

      35<X≤40

      10%

      40<X≤55

      9%

      55<X≤70

      8%

      70<X≤100

      7%

      100<X

      6%

      2、電泳(采用恒壓)

      2.1、接通凝膠電泳儀的電源,先在 80V 下電泳至溴酚藍染料從濃縮膠進入分離膠。(約 30 分鐘)

      2.2、提高電壓至 120V,繼續電泳直至溴酚藍到達凝膠底部為止。

      三、轉膜

      1.1、從玻璃板中取出凝膠,在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認出加樣次序,將其浸泡于轉移緩沖液中。

      1.2、取與膠同樣大小的 NC 或 PVDF 膜,NC 膜用轉移緩沖液浸泡 5 分鐘以上待用,PVDF 膜需要先放入甲醇中浸泡5-10 分鐘,再放入轉移緩沖液浸泡。

      注意:目的蛋白分子量大于 20kDa 選擇 0.45μm 的NC 膜,小于 20kDa 選擇 0.2μm 的NC 膜或 0.22μm 的PVDF 膜。

      1.3、按從負極到正極順序在轉移夾內依次放置預先經轉移緩沖液浸泡的海綿、三層濾紙、凝膠、膜、三層濾紙、海綿,保證每層之間沒有氣泡。

      1.4、將轉移夾放入預先加滿轉移緩沖液的轉移槽中,膜在正極、膠在負極,整個轉移槽放置入冰水浴中,按照下表條件進行電泳。

      注意:事先裁剪濾紙和膜,1 張膜和 6 張濾紙??磕ひ粋葹V紙可裁剪稍小些,以防與另一側濾紙邊緣連接形成短路。轉膜條件的選擇:

      分子量( kDa

      轉膜條件

      X≤10

      恒流 200mA, 30min

      10<X≤15

      恒流 200mA, 40min

      15<X≤20

      恒流 200mA, 50min

      20<X≤50

      恒流 200mA, 1kDa/min+20min

      50<X≤100

      恒流 200mA, 1kDa/min+30min

      100<X≤150

      恒流 250mA, 1kDa/min+20min

      150<X≤180

      恒流 270mA,1kDa/min

      180<X

      恒流 270mA,1kDa/min

      四、封閉

      把膜取出后放入合適孵育容器中,加入 5%脫脂奶粉/TBST,室溫搖動孵育 1 小時。

      五、抗體孵育

      1、一抗孵育:直接將一抗加入封閉液中進行適當稀釋,室溫 2h 或 4℃振搖孵育過夜;

      2、以 TBST 洗膜,5 分鐘 x 4 次;

      3、二抗孵育:二抗用 TBST 稀釋,室溫下振搖孵育 1h;

      4、以 TBST 洗膜,5 分鐘 x 4 次。

      注意:清洗換液過程中應避免膜干掉,否則會產生非特異背景。

      六、曝光

      1、根據膜的大小,按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液,將 ECL 試劑盒中的 A、B 組分按 1:1 的比例混合,配置成發光檢測工作液。

      2、用鑷子取出膜,膜下緣輕輕接觸吸水紙,去除膜上多余液體,將工作液加到膜上,室溫孵育 1-2min,此步驟可在潔凈保鮮膜上完成。

      3、壓片檢測:將膜固定于片夾內,暗室壓片 1 分鐘,立即顯影定影,根據結果調整壓片時間,或直接分別壓片 30s、1min、3min、5min,然后一起顯影定影觀察結果。

      4、熒光成像儀檢測:將膜放到熒光成像儀內,參考儀器說明書進行檢測。


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